Les productions
de sondes en cours ou prévues portent sur les organismes suivants
: homme (mais la puce produite est applicable à la plupart des mammifères,
cf ci-dessous), souris, rat, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa,
drosophile, tomate, Arabidopsis thaliana, Medicago truncatula, Phytophtora
parasitica, Anemonia viridis, Spodoptera frugiperda. A cela s'ajoutent des
calculs de sondes effectuées sur d'autres organismes (ex. Tropheryma
whipplei). Les puces mises en œuvre sur la plate-forme sont de type lames
de verre, et sont analysées par hybridation différentielle de
deux échantillons marqués avec des sondes fluorescentes distinctes.
Alternativement, l'un des deux échantillons peut être remplacé
par une solution d'ARN de référence, qui sert de contrôle
unique au travers d'une grande série de quantifications. La plate-forme
utilise trois types de sondes distinctes :
Sondes PCR pan-mammifères :
La plate-forme a développé une puce « mammifère
» originale disposant actuellement de ~7000 sondes (dont ~5000 validées
par séquençage et ~2000 en cours de synthèse). Les
sondes correspondent à des sondes humaines présentant une identité
supérieure ou égale à 80% avec l'orthologue murin, ce
qui permet de fait des études comparatives à grande échelle
de plusieurs espèces avec un outil cohérent. La mise en place
de méthodes de fabrication propriétaires permet l'amplification
des sondes sans nécessiter la construction de banques EST ou pleine
taille, les productions se faisant à partir de mélanges complexes
d'ARN rétro-transcrits. L'optimisation des méthodes par la
plate-forme permet une amplification de 85% des séquences sélectionnées,
et la production de 3 à 5 µg d'ARN par série de production.
La même méthode de fabrication est utilisable pour la production
d'autres puces, comme les puces « promoteurs ». La production
d'amplicons PCR, leur purification et le contrôle qualité (taille
et quantification) sont annotés dans la base MedLab (voir ci-dessous).
Sondes PCR classiques : Parallèlement,
les puces Spodoptera frugiperda (1500 sondes distinctes), tomate (4000 sondes),
anémone de mer (1500 sondes), et Phytophtora parasitica (6000 sondes)
ainsi que les puces "thématiques" drosophile, Arabidopsis thaliana
et Medicago truncatula (±500-800 sondes chacune) sont fabriquées
par amplifications de sondes à partir de collections d'EST en utilisant
des amorces universelles flanquantes. La production d'amplicons PCR, leur
purification et le contrôle qualité (taille et quantification)
sont annotés dans la base MedLab (Accès aux sondes
cDNA).
Sondes oligonucléotides : Dans le cadre
de sa participation à la mise en place d'une ressource nationale en
sondes oligonucléotidiques (longueur~50 bases), la plate-forme a mis
en place les méthodes pour produire et analyser des puces oligos longs.
La collection propre de la plate-forme se limite actuellement à ~500
sondes humaines, dérivées de la future collection nationale
pan-génomique. Les résultats obtenus par la plate-forme lors
du test national CIT lui permettra d'accéder à la ressource
nationale, et d'imprimer des puces pan-génomiques homme et souris
(~20000 sondes distinctes pour chaque espèce).