L’équipe « Physiologie Génomique des Eucaryotes » est actuellement composée de 3 chercheurs
statutaires (1 DR1 CNRS, 1CR1 CNRS, 1 CR2 CNRS, 1MCF UNSA), auxquels s’ajoutent 3 post-doctorants.
Le support technique (1 IR2 CNRS, 1 IE2 statutaire, 1 IE2 et 1 AI en CDD) est uniquement affecté à
l’activité de la plate-forme « puces à ADN ».
Notre projet de recherche s’articule autour des deux axes suivants :
1. « Transcriptomique expérimentale ».
développements méthodologiques autour des puces à ADN
(produites par la plate-forme ou disponibles commercialement),
afin de proposer notamment aux collaborateurs de la plate-forme
des approches CGH et CHIP-on-chip, et des outils de fouille de données associés.
2. « Homéostasie des tissus épithéliaux lors de stress mécaniques, chimiques ou infectieux».
Fonctionnement normal ou pathologique du tissu épithélial respiratoire.
Analyse de la réponse des cellules épithéliales à différents stress.
Analyse fonctionnelle des miRNA (miR-155, miR-210, ainsi que
sur les clusters miR-17-92 et miR-15a-16, dont l’importance est
apparue dans plusieurs des cribles déjà réalisés). Ce travail comporte une
partie de développement d’outils génériques ré-utilisables pour d’autres
miRNA identifiés lors de différents cribles.
THEMATIQUE N°1. « Transcriptomique expérimentale »
Nous développons des méthodes originales d’utilisation des puces à ADN, accessibles à tous les
biologistes. La plate-forme RIO/RNG de l’IPMC, créée en 1999 par Pascal Barbry, sert d'appui
pour plusieurs des thématiques de l’équipe « Physiologie Génomique des Eucaryotes ».
Cette plate-forme, identifiée par le Réseau National des Génopoles, le RIO (Réunion Inter
Organismes, qui regroupe le CEA, le CNRS, l'INRA et l'INSERM), et la Canceropôle PACA, a
été certifiée ISO9001 version 2000 pour la fabrication et l'hybridation de puces à ADN en juin 2006.
a. Projet Mediante / puces Resogen.
Dans le cadre d’un consortium franco-anglais, deux collections d'oligonucléotides ont été conçues
pour la fabrication de puces pangénomiques. Des scores de spécificité et de sensibilité originaux
ont permis de sélectionner 25342 oligonucléotides humains et 24 109 oligonucléotides murins.
Ces scores ont également permis de comparer in silico les deux puces à des puces commerciales
(Agilent, Illumina, Affymetrix). Ils démontrent la bonne qualité des deux sets, qui est confirmée
par des expériences d’hybridations (corrélation ~ 80%). Plus de 4 000 puces ont déjà été distribuées
à la communauté académique. Ce travail valide une méthode générique pour produire toute nouvelle
collection de sondes spécifiques chez d’autres espèces. Toute l'information associée à ces sondes
est accessible librement sur la base de données baptisée Mediante (http://www.microarray.fr).
Ce travail a été décrit dans 2 publications (Le Brigand et al, 2006, 2007).
b. Création d’une puce permettant la détection des micro ARN (miRNA).
Les miRNA apparaissent comme des modulateurs centraux du métabolisme et de l’homéostasie cellulaire.
Certaines études d’expression indiquent que les profils des miRNAs sont extrêmement informatifs,
reflétant le lignage et l’état de différenciation cellulaire6 Afin de disposer d’un outil applicable
dans nos modèles, nous avons bâti une puce comportant l’ensemble des séquences connues de miRNA
matures, toutes espèces confondues (~1500 séquences distinctes, couvrant l’ensemble des séquences
matures de miRNA disponibles dans mirBase V.8.1, complétée par ~170 miRNA prédits par l’équipe de
Daniel Gautheret). Les protocoles d’utilisation nous permettent actuellement de définir des profils
d’expression à partir de quelques centaines de nanogrammes de petits ARNs. La première utilisation
de cette puce a fait l’objet d’une publication dans Science (Triboulet et al, 2007).
c. Génomique clinique
Dans le cadre d’une collaboration mise en place entre le service d’Hématologie Biologique du CHU
de Nice, dirigé par le Professeur Sophie Raynaud, et la plate-forme transcriptome, le transfert
vers la clinique des méthodologies de la plate-forme a été mis en place. L’analyse des profils
d’expression génique est un nouvel outil d’étude du génome pour déchiffrer la diversité biologique
et clinique des hémopathies malignes. Que ce soit dans le cadre des leucémies aiguës lymphoblastiques
ou myéloblastiques, des leucémies lymphoïdes chroniques, de différents types de lymphomes,
des myélomes, l’analyse des profils d’expression génique a été utilisée de façon extensive au
cours des dernières années et fournit un cadre au diagnostic moléculaire des cancers hématologiques44.
Ces méthodes ont reproduit les classifications existantes et mis en évidence de nouveaux sous groupes
au sein des catégories diagnostiques connues. Elles ont démontré que les réponses au traitement sont
dictées par de multiples caractères biologiques tumoraux. Notre objectif est de rejoindre l’European
Leukemia Network (ELN), qui a démarré en mars 2005 un programme de transfert de technologie dénommé
MILE - Microarray Innovations in Leukemia -. Ce programme prévoit de comparer la fiabilité diagnostique
des profils transcriptomiques et des outils diagnostiques de routine chez 4000 patients leucémiques,
appartenant à 21 sous types de leucémies aiguës, de leucémies chroniques, ou de myélodysplasies.
Des résultats préliminaires présentés en décembre 2005 au congrès annuel de l’American Society of
Hematology (abstract # 757, Blood ; 106, issue 11 november 16, 2005) démontre pour la première
fois une forte reproductibilité des analyses par profils d’expression sur des échantillons
leucémiques identiques provenant de plusieurs centres internationaux distincts. Ces résultats
posent les bases d’une initiative de recherche clinique internationale à laquelle nous souhaitons
participer.
d. CHIP-on-chip
La mise en place de la station Affymetrix permettra par ailleurs la réalisation de plusieurs autres
types d’expériences, comme l’hybridation génomique comparative (CGH) ou le CHIP-on-chip. Ces approches
seront implantées sur la plate-forme, et les outils ad hoc de fouilles de données seront mis en place.
e. Fouilles des données. Web sémantique.
Il s’agit d’une collaboration avec les Drs Khaled Khelif et Rose Dieng (projet ACACIA, INRIA de Sophia
Antipolis). L’obtention d’une quantité importante d’informations dans le cadre des approches
transcriptomiques rend nécessaire la mise en place d’outils de fouille de données. Cette approche
s’appuie sur les technologies du web sémantique pour extraire des connaissances à partir de documents
textuels fournis par les utilisateurs, en se basant sur des ontologies existantes ou des annotations
sémantiques d’articles scientifiques. Ce travail a abouti à la mise en place de deux outils :
(1) MeatAnnot, qui permet la génération d’annotations sémantiques à partir des ontologies existantes ;
(2) MeatSearch, qui permet de faire des inférences à partir de ces annotations.
f. Modélisation
Un dernier aspect sur lequel nous souhaitons travailler concerne la modélisation des réseaux géniques.
Ce travail sera réalisé dans le cadre d’une collaboration avec le projet COMORE, animé par le Docteur
Jean-Luc Gouzé, à l’INRIA de Sophia Antipolis, en collaboration avec le Docteur Madalena Chaves,
qui vient d’être recruté par cette équipe, et qui a précédemment travaillé sur ce thème45.
Nous souhaiterions plus particulièrement mettre en place une approche pour modéliser les interactions
existant entre miRNA et transcrits. Nous pensons notamment que la nature de l’interaction entre miRNA
et mRNA (de type n:p, où n et p sont deux entiers) peut permettre de décrire des systèmes biologiques
extrêmement originaux. Notre contribution sur ce projet se situera au niveau du choix du système
biologique, et sur la génération d’expériences permettant de tester les prédictions de différents modèles.
THEMATIQUE N°2. « Homéostasie des tissus épithéliaux lors de stress mécaniques, chimiques ou infectieux»
Un des nos objectifs est de comprendre les mécanismes de réponse mis en place par les cellules épithéliales
normales ou pathologiques au cours de stress. Initialement envisagée dans le seul contexte pulmonaire,
cette thématique s’est progressivement élargie à d’autres modèles expérimentaux, accessibles localement
(blessure mécanique de kératinocytes, infection de l'estomac par H. pylori, survie de transplants hépatiques,...).
a. Réponse à un stress chimique : cas de la fibrose pulmonaire induite à la bléomycine
Initié à l’occasion de la visite en 2003 à l’IPMC du Dr Yves Berthiaume (CHU Montréal), ce projet fait
l’objet d’une collaboration entre nos deux équipes, et l’équipe du Dr Paul Wolters (CVRI, University
of California, San Francisco). L’établissement de la fibrose pulmonaire (5 à 10 cas par 100 000 habitants)
est souvent causé par une toxicité d’origine médicamenteuse ou chimique, mais les traits moléculaires
conduisant à son développement restent encore mal élucidés. Nous avons tiré parti des sensibilités très
distinctes des souches murines C57/BL6 et Balb/C à une fibrose induite par la bléomycine pour identifier
des gènes jouant un rôle dans l’établissement de la fibrose. En comparant les profils d’expression
pangénomiques de poumons issus de souris C57/BL6 (qui développe une fibrose) et Balb/C (qui n’en développent pas),
nous avons mis en évidence l’expression différentielle de 25 gènes. Des études fonctionnelles montrent
une corrélation étroite des niveaux d'expression de la cathepsine C (une dipeptidyl-peptidase essentielle
pour l'activation des sérine protéinases produites par les cellules inflammatoires), et de TIMP-3
(un inhibiteur d’ADAM17, l'enzyme de clivage du pro-TNFalpha), avec l'activation des protéases du neutrophile
et l’apparition d’un syndrome inflammatoire dépendant du TNFalpha, tous deux associés à la fibrose pulmonaire.
Les ciblages pharmacologiques de la cathepsine C, de TIMP3 ou d’ADAM17 pourraient permettre d’élargir les
indications thérapeutiques de la bléomycine en cancérologie, voire de développer de nouvelles approches
médicamenteuses contre la fibrose pulmonaire. Nous avons ensuite cherché si des modifications d’expression
de certains miRNA ne pouvaient pas également participer au développement de la fibrose. A cette fin, des
profils d’expression sur puces miRNA ont été établis sur des préparations de miRNA issues de souris
traitées à la bléomycine. C’est dans ce contexte que nous nous sommes intéressés à miR-155, dont le
précurseur (nommé Bic) est exprimé par les fibroblastes pulmonaires. Une des raisons pour lesquelles
nous nous sommes intéressé à miR-155 est que l’une de ses cibles prédites est le Keratinocyte Growth
Factor (KGF), produit du gène fgf-7, dont l’expression est également spécifique des cellules mésenchymateuses.
Nous avons confirmé expérimentalement cette régulation (Pottier et al, en préparation). Le KGF n’agissant
que sur les cellules épithéliales du poumon, nous proposons que la régulation du KGF par miR-155 pourrait
agir comme régulateur négatif de la prolifération des cellules épithéliales pulmonaires. miR-155 a
également été décrit comme oncogénique dans les lymphomes de Burkitt10, les leucémies lymphoides B11 et
certains carcinomes12. Ainsi, son rôle fonctionnel varierait-il en fonction de son site d’expression
cellulaire. Ce travail a fait l'objet d'une publication dans Am J Respir Crit Care Med (Pottier et al, 2007).
b. Réponse à un allergène: Asthme et rhinite allergique.
Dans cette étude, menée par Lisa Chami-Giovannini dans le cadre d'une collaboration avec le service de
pneumologie-pédiatrique du CHU de Nice, il s'agissait : (1) de mettre en place une stratégie d’analyse
pangénomique applicable à un faible nombre de cellules (~500 000), extraites de groupes de patients
aux profils cliniques bien caractérisés ; (2) d’évaluer la contribution de l’épithélium respiratoire
au développement de la rhinite allergique et de l’asthme. Trois groupes expérimentaux, présentant
une rhinite allergique aux acariens (isolée, associée à une hyperréactivité bronchique ou à un asthme)
ont été profilés sur puces pangénomiques. Parmi les 200 gènes les plus significativement modulés
entre asthmatiques et témoins, 35 sont situés sur des loci de susceptibilité de l’asthme et 35 ont
été reliés à l’asthme dans la littérature, suggérant une contribution de l’épithélium cilié à la
pathologie. Ces données renforcent par ailleurs le concept de « rhino-bronchite allergique »13,
selon lequel des traits communs seraient partagés par l’épithélium nasal et par l’épithélium
bronchique lors de ces pathologies. Une classification supervisée a permis de déterminer un set
d’une vingtaine de sondes capable de discriminer les asthmatiques des témoins. Toutefois, le même
classificateur ne permet pas de distinguer rhinites simples et rhinites avec hyperréactivité bronchique.
Cette étude doit maintenant être croisée avec des informations obtenues lors d’un profilage de 51 agents
anti-inflammatoires effectué sur des cellules respiratoires en culture primaire (collaboration avec
société CEREP dans le cadre d’un contrat GenHomme).
c. Réponse à un stress mécanique : le cas de la cicatrisation kératinocytaire.
Ce projet est réalisé en collaboration avec le Dr Gilles Ponzio (Inserm U385, Nice). La cicatrisation
cutanée nécessite la migration, la prolifération et la différentiation des kératinocytes situés sur
le bord de la blessure. Afin de clarifier la nature des événements biologiques mis en œuvre dans ce
processus, nous avons examiné les modifications génomiques sur des cultures de kératinocytes. Un modèle
original de scarification des monocouches cellulaires a permis d’identifier 161 nouveaux marqueurs de
la réparation épidermique. Les données d'expression révèlent le rôle des voies ERK, p38[MAPK] et PI3
kinase (PI3K). Combinées à une approche pharmacologique, elles montrent que: (1) l'inhibition de la
voie ERK bloque totalement la fermeture de blessure en empêchant l’activation de 32 des gènes stimulés
durant la « cicatrisation » (Fos, FST, HBEGF,EGR1, Ets1, Has 3, JunB, PPARD…); (2) l'inhibition de la
voie P38[MAPK] retarde sans la bloquer la cicatrisation, en affectant l’expression de 26 gènes parmi
lesquels IRF6, ITGB4, LAMA3, RASA1, RRAD; (3) l'inhibition de la kinase PI3K accélère la fermeture de
la blessure et augmente l’expression de HAS3, HBEGF et Ets1, trois gènes liés à la transformation des
cellules épithéliales. Nos résultats démontrent que le processus de cicatrisation résulte d’un équilibre
précis entre l’activation des voies ERK, p38 et PI3K, la dérégulation de l’une d’entre elles conduisant
à un dérèglement de l’ensemble du processus. Ces travaux ouvrent ainsi plusieurs voies intéressantes
dans le domaine pharmacologique, et plus particulièrement celui lié au traitement des lésions
dermatologiques (escarres, chéloides,…). Ce travail a fait l'objet d'une publication dans
J. Biol. Chem. (Fitsialos et al, 2007).
d. Réponse de l’épithélium respiratoire aux infections à Staphylococcus aureus.
Ce travail a été réalisé en collaboration avec le groupe du Dr Edith Puchelle (Inserm U514, Reims).
Les infections pulmonaires chroniques représentent la plus grande cause de morbidité chez les patients
atteints de mucoviscidose (CF). L’infection précoce des poumons CF par des bactéries comme Staphylococcus
aureus est caractéristique de la pathologie. Une première étude, sur le modèle cellulaire des MM39
(cellules épithéliales humaines issues des glandes sous muqueuses), nous a permis de préciser les
voies métaboliques affectées par un contact avec les bactéries vivantes ou avec une fraction soluble
de Staphylococcus aureus, riche en facteurs de virulence16. Une deuxième étude a permis de préciser
les comportements spécifiques de cellules épithéliales respiratoires humaines CF (KM4, portant la
mutation deltaF 508), et non CF (MM39) après un contact avec le surnageant bactérien17. Dans les deux
études, la réponse transcriptionnelle traduit une forte réponse immunitaire innée, causée par
l’activation des voies de TNFalpha et de NFkB. L’expression de plusieurs ARN (S100A8, S100A9, S100A11)
est fortement augmentée lors des stades tardifs de l’infection chez les cellules CF, et à un moindre
degré chez les cellules non CF. Cet effet est probablement en lien avec une activation dépendant du
TNFalpha, précédemment décrite. Une méta-analyse regroupant ces données avec plusieurs autres comparaisons
CF versus non CF (homme, souris, infections virales ou pyocyaniques) doit maintenant permettre de
reconstruire les voies métaboliques associées à l’état pro inflammatoire spécifique des cellules
déficientes en activité CFTR. Ce travail a fait l'objet de 2 publications (Moreilhon et al, 2005;
Gras et al, in preparation).
e. Infections à Helicobacter pylori.
Helicobacter pylori est la première bactérie à avoir été impliquée dans un processus carcinogène
(carcinome gastrique de type intestinal et diffus, lymphome de MALT). Le but de l'étude était de
caractériser le transcriptome de 54 patients caucasiens français, infectés par H. pylori, dans le
but de proposer un modèle de transformation des cellules infectées. Les profils obtenus dépendent
clairement: 1) de l'ampleur de l'infiltration leucocytaire ; 2) de la charge bactérienne ;
3) de l’expression des facteurs de virulence vacA, babA2 et cagA. Alors qu’activation de molécules
de la voie TLR, apoptose, et blocage du cycle cellulaire constituent autant de réponses attendues
lors d’une infection bactérienne gram-négative, la détection de marqueurs d’une réponse de type Th1,
médiée par le système majeur d’histocompatibilité de classe II, avec activation de gènes de réponse
à l’interféron, évoque certains états précancéreux. En accord avec ce modèle, nous avons identifié
8 transcrits abondamment exprimés dans des tissus cancéreux (STAT6, UBD, CXCL13, MD2, MAPK8, MMP7,
RANKL, CCL18), et 3 transcrits exprimés dans des cellules souches (GATA6, IFITM1, WFDC2), dont les
profils d’expression ont été validés par tissu-microarray. Cette étude fournit de nouveaux outils
diagnostiques pour le dépistage précoce de la carcinogenèse liée aux infections à H. pylori.
Ce travail a fait l'objet d'une publication (Hofman et al, 2007).
f. Ischémie-reperfusion du foie humain lors de la transplantation
Un Contrat d'Incitation à la Recherche Clinique (Dr Rafaele Cursio et Pr Jean Gugenheim, Nice) a permis
la collecte d’une vingtaine de biopsies de transplants hépatiques humains, prélevées 30-45 minutes
après re-perfusion de l'organe chez le receveur. La signature transcriptomique associée au stress
d’ischémie-reperfusion a ainsi été mesurée dans des conditions réelles de transplantation.
L’annotation des 200 gènes les plus significativement régulés révèle une activation de la réponse
inflammatoire aiguë au détriment des fonctions basales du foie (activité oxydoréductase,
métabolisme des acides aminés,…). En stratifiant les patients en fonction de paramètres cliniques
(durées de l’ischémie froide, taux de transaminases pré et post opératoires), nous avons ensuite
recherché une signature moléculaire des foies les plus "lésés", afin de corréler l’expression de
certains gènes au degré de souffrance hépatique. Ces analyses révèlent la surexpression des gènes
FOS et DUSP1, impliqués dans la prolifération et différentiation cellulaire, de CXC et CC chimiokines
responsables de l’attraction de neutrophiles, et de la gélatinase B (MMP-9). On sait qu’un niveau
élevé de MMP-9 est détecté dans les sérums de patients en cas de rejet aigu de la greffe25.
Ces résultats corroborent par ailleurs nos propres données obtenues dans un modèle d’ischémie-reperfusion
sur foie de rat isolé, montrant un effet protecteur d’un inhibiteur de MMP-9. Ce travail a fait
l'objet de 2 publications (Defamie et al, 2007a et 2007b).